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甲基化

 甲基化检测(msp)实验检测
 
 
1、DNA提取
 
(1)于液氮中取组织约100mg,用已消毒的剪刀将组织剪碎,放入标记好的1.5mL EP管中,加入300μL TNES Buffer,涡旋混匀,加入10μL RNase A/T1 Mix,室温静置5min,加入20μL 蛋白酶K,37℃水浴过夜。
 
(2)加入1/4体积饱和NaCl溶液,颠倒混匀,涡旋30s。室温,14000rpm,20min。
 
(3)取上清于一新1.5mL EP管中,加入1/2体积Tris-饱和酚,1/2体积三氯甲烷,涡旋1min。室温,14000rpm,20min。
 
(4)弃上清,加入1mL无水乙醇,颠倒混匀,涡旋30s。室温,14000rpm,5min。
 
(5)弃上清,1mL 70%乙醇洗涤沉淀。室温,14000rpm,5min。
 
(6)弃上清,室温风干酒精。加入50μL TE Buffer,55℃水浴20min,溶解DNA。-20℃保存。
 
2、重亚硫酸盐处理DNA(ZYMO :Methylation-Gold Kit,货号:D5005S)
 
重亚硫酸盐DNA甲基化采用Methylation-Gold Kit试剂盒进行(ZYMO公司),主要步骤如下:
 
(1)取20 μL基因组DNA(500 pg-2 μg)样品于PCR管中,加入130 μL CT转换试剂,振荡混匀。
 
(2)将PCR管放入PCR仪中,98℃,10 min;64℃,2.5 h;4℃,放置20 h。
 
(3)加入600 μL M-Binding缓冲液到Zymo-Spin吸附柱中,将吸附柱放回收集管中。
 
(4)将2)中的样品加到3)中的Zymo-Spin吸附柱里,颠倒混匀。
 
(5)12000 g离心30s,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中。
 
(6)向吸附柱中加入100 μL M-Wash缓冲液(已加入无水乙醇),12000 g离心30s,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中。
 
(7)向吸附柱中加入200 μL M-Desulphonation缓冲液,室温静置15-20 min,12000 g离心30s,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中。
 
(8)向吸附柱中加入200 μL M-Wash缓冲液,12000 g离心30s,倒掉废液。重复一次。
 
(9)将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加20μL M-Elution缓冲液,室温放置5min,12000 g离心30s,将溶液收集到离心管中。
 
3、PCR扩增及凝胶电泳
 
(1)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系。
 
试剂
 
                                使用量
 
2×HieffTM PCR Master Mix
 
10.0 μL
 
10μM上游基因引物
 
1.0 μL
 
10μM下游基因引物
 
1.0 μL
 
基因组DNA
 
2.0 μL
 
ddH2O
 
up to 20.0 μL
 
 
 
(2)PCR扩增程序:预变性                                    98℃,4min
 
变性                                  98℃,30s      
 
退火                                  56℃,30s    40 cycles
 
延伸                                  72℃,30s                
 
末段延伸                              72℃,10min
 
 
 
(3)凝胶制备及电泳:① 50*TAE,纯水配成1*TAE工作液(980mL纯水+20mL 50*TAE)。
 
                     ② 称取2g西班牙琼脂糖,加100mL 1*TAE工作液,微波溶解,制成2%琼脂糖凝胶,冷却至60℃,加入10μL GoldView I型核酸染色剂,混匀倒入槽中。
 
                     ③ 拔梳,加入10μL PCR产物(with Dye)。
 
                     ④ 电压120V,25min,紫外仪下观察并拍照。
 

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