miRNA
1、RNA提取
对于贴壁细胞样本
(1)用移液器小心吸去培养基,加入1mL 4℃预冷的PBS溶液,小心摇晃洗去残余培养基,用移液器吸尽PBS溶液,加入1mL Trizol溶液,反复吹打培养瓶/培养基底部及四周,将细胞充分吹打到Trizol中。加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。
(2)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。
(3)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。
对于悬浮细胞样本
(1)低速离心收集细胞,加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬,300g离心10 min,吸除上清。重复以上操作两次,收集细胞沉淀。加入1mL Trizol溶液,反复吹打将细胞充分吹打到Trizol中加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。
(2)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。
(3)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。
对于组织样本
(1)标本于-80℃或液氮中保存,用已经消毒的工具于冰上取约100mg组织,于1mL预冷的Trizol中充分研磨,匀浆液小心倒入1.5mL EP管中,加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。
(2)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。
(3)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。
对于血液样本
(1)取500μL全血于15mL离心管中,加入10倍体积红细胞裂解液,混匀,室温避光静置10min。
(2)室温,300g,离心10min,弃上清,重复步骤(1),室温,300g,离心10min,弃上清。
(3)PBS重悬细胞沉淀,室温,300g,离心10min,弃上清,100μL PBS重悬细胞,加入1mL Trizol,混匀,静置5min,加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。
(4)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。
(5)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。
2、第一链cDNA合成
第一链cDNA的合成采用M-MLV逆转录酶试剂盒进行(Invitrogen™公司),主要步骤如下:
(1)在冰上配置如下反应液
试剂 |
使用量 |
内参基因特异性逆转录引物(10μM) |
1.0μL |
目的基因特异性逆转录引物(10μM) |
1.0μL |
dNTP Mix |
1.0μL |
RNA |
10.0μL |
PCR仪上65℃5 min
冰上2 min
(2)在冰上配置如下反应液
试剂 |
使用量 |
步骤1反应液 |
|
5*第一链合成缓冲液 |
4.0μL |
0.1M DTT |
2.0μL |
PCR仪上37℃2 min
(3)在冰上配置如下反应液
试剂 |
使用量 |
步骤2反应液 |
|
M-MLV逆转录酶 |
1.0μL |
PCR仪上37℃50 min
75℃15 min
4℃
3、荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是在Life technologies公司的StepOne™ Real-Time PCR仪上完成,每个样品均作3个复孔,使用SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒进行(TaKaRa公司):
(1)反应程序为:预变性 95℃,1min
循环(40次) 95℃,15s→58℃,20s→72℃,45s
熔解曲线 60℃→95℃,每20s升温1℃
(2)反应体系为:
试剂 |
使用量 |
2× qPCR Mix |
5.0 μL |
引物工作液(2.5μM) |
1.0 μL |
Template |
1.0 μL |
ddH2O |
2.8 μL |
Rox |
0.2 μL |