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miRNA
在设计和构建miRNA sponge抑制载体时，通过优化设计增加了结合位点以增强吸附能力，提高了对成熟miRNA或siRNA的抑制效果，减弱了细胞中miRNA或siRNA的基因沉默功能，以便用于miRNA或siRNA的功能丧失研究。例如，可以构建多靶向miRNA海绵序列的质粒载体，以便在多重miRNA的调控环境中实现高效功能抑制。具体方法如下：
步骤1. 多靶向miRNA海绵慢病毒载体系统设计
基于miRbase中的miR-155和miR-31的成熟序列，设计一组靶向miR-155和miR-31的引物。引物中第9-12碱基处设置错配位点，每个引物带有四个错配位点，并正反向重叠16个碱基。同时，在正反向引物中分别引入EcoRI和BamHI酶切位点。
步骤2. 构建PLVX-CMV-EGFP-puro质粒
构建基础质粒PLVX-CMV-EGFP-puro，为后续实验提供载体。
步骤3. 克隆miRNA海绵序列
使用步骤1中设计的引物进行退火和延伸后，得到双链DNA片段。对其进行酶切并连接至PLVX-CMV-EGFP-puro质粒中，构建得到分别包含miRNA海绵序列的PLVX-EGFP-4xmi155sponge-puro和PLVX-EGFP-4xmi31sponge-puro质粒，并通过酶切和测序验证质粒的正确性。
步骤4. 构建PLVX-EGFP-8xmi155sponge-puro和PLVX-EGFP-8xmi31sponge-puro质粒
在PLVX-EGFP-4xmi155sponge-puro基础上扩展，构建包含8个miR-155靶位点的PLVX-EGFP-8xmi155sponge-puro质粒；同理，基于PLVX-EGFP-4xmi31sponge-puro质粒，构建包含8个miR-31靶位点的PLVX-EGFP-8xmi31sponge-puro质粒。
步骤5. 构建多靶向PLVX-EGFP-8xmi155&31sponge-puro海绵慢病毒载体
对步骤4中获得的PLVX-EGFP-8xmi155sponge-puro质粒和PLVX-EGFP-8xmi31sponge-puro质粒分别进行双酶切：
a) 为获得插入片段8xmi155sponge或8xmi31sponge，使用SalI-HF和BclI双酶切PLVX-EGFP-8xmi155sponge-puro质粒或PLVX-EGFP-8xmi31sponge-puro质粒。
b) 为获得开环载体，使用SalI-HF和BamHI-HF双酶切PLVX-EGFP-8xmi31sponge-puro质粒或PLVX-EGFP-8xmi155spongeonge-puro质粒，得到相应的开环质粒。
c) 将8xmi155sponge插入片段与开环的PLVX-EGFP-8xmi31sponge-puro质粒连接，或将8xmi31sponge插入片段与开环的PLVX-EGFP-8xmi155sponge-puro质粒连接。重组质粒后转化感受态细胞，筛选单克隆，并通过酶切验证PLVX-EGFP-8xmi155&31sponge-puro质粒的正确性，最终获得含miRNA海绵序列的PLVX-EGFP-8xmi155&31sponge-puro质粒
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