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siRNA
RNA干扰（RNAi）技术，作为探究多种细胞类型中蛋白质功能的关键手段，凭借其高效敲低基因表达的能力，已成为该领域的首选方法。在哺乳动物细胞的基因敲低实践中，传统的RNAi策略依赖于精心设计的合成RNA二聚体结构，这一结构由两条未经化学修饰的21个核苷酸长度的寡核苷酸链组成。这两条链通过退火过程，精确折叠成短小干扰RNA（siRNA），从而发挥其基因沉默的效能。
实验流程：
1.设计合成RNA二聚体：
◆ 选择目标序列：基于生物信息学分析，精确选定目标基因中的特定序列，确保siRNA能够高效结合并引导RNA诱导沉默复合体（RISC）进行切割。
◆ 合成未经修饰的寡核苷酸：采用高质量的核苷酸原料，合成两条完全互补的21聚体寡核苷酸链，确保其在退火过程中能形成稳定的双链结构。
2.退火形成siRNA：
◆优化退火条件：在特定的温度和时间条件下，使两条寡核苷酸链通过碱基配对原则自发退火，形成短小干扰RNA（siRNA）。此步骤需严格控制实验条件，以确保siRNA的高效形成和稳定性。
3.导入哺乳动物细胞：
◆选择适当的转染方法：根据细胞类型和实验需求，选用脂质体转染、电穿孔或病毒载体等高效、低毒的转染技术，将siRNA导入目标哺乳动物细胞。
◆验证转染效率：通过荧光标记或其他检测方法，评估siRNA在细胞内的转染效率和分布情况，确保实验的有效性。
4.检测基因敲低效果：
◆定量检测：利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）或RNA测序技术，检测目标基因mRNA水平的降低程度，以评估siRNA的敲低效率。
◆蛋白质水平验证：通过Western blot等蛋白质检测技术，进一步验证目标基因蛋白质表达的减少情况，确保基因敲低效果的可靠性。
5.功能研究与应用：
◆细胞功能分析：基于基因敲低后的细胞模型，开展细胞增殖、凋亡、迁移等生物学功能的研究，揭示目标基因在特定细胞类型中的功能和作用机制。
◆疾病模型构建与药物筛选：利用基因敲低技术构建疾病相关细胞模型，为药物筛选和疗效评估提供有力的工具平台。
| 每管siRNA的量 | 无核酶水的体积 | 终浓度 |
| 1 OD* | 125 μL | 20 μM |
| 25 μL | 100 μM | |
| 5 nmol | 250 μL | 20 μM |
| 50 μL | 100 μM |
实验流程：
◆ 选择目标序列：基于生物信息学分析，精确选定目标基因中的特定序列，确保siRNA能够高效结合并引导RNA诱导沉默复合体（RISC）进行切割。
◆ 合成未经修饰的寡核苷酸：采用高质量的核苷酸原料，合成两条完全互补的21聚体寡核苷酸链，确保其在退火过程中能形成稳定的双链结构。
2.退火形成siRNA：
◆优化退火条件：在特定的温度和时间条件下，使两条寡核苷酸链通过碱基配对原则自发退火，形成短小干扰RNA（siRNA）。此步骤需严格控制实验条件，以确保siRNA的高效形成和稳定性。
3.导入哺乳动物细胞：
◆选择适当的转染方法：根据细胞类型和实验需求，选用脂质体转染、电穿孔或病毒载体等高效、低毒的转染技术，将siRNA导入目标哺乳动物细胞。
◆验证转染效率：通过荧光标记或其他检测方法，评估siRNA在细胞内的转染效率和分布情况，确保实验的有效性。
4.检测基因敲低效果：
◆定量检测：利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）或RNA测序技术，检测目标基因mRNA水平的降低程度，以评估siRNA的敲低效率。
◆蛋白质水平验证：通过Western blot等蛋白质检测技术，进一步验证目标基因蛋白质表达的减少情况，确保基因敲低效果的可靠性。
5.功能研究与应用：
◆细胞功能分析：基于基因敲低后的细胞模型，开展细胞增殖、凋亡、迁移等生物学功能的研究，揭示目标基因在特定细胞类型中的功能和作用机制。
◆疾病模型构建与药物筛选：利用基因敲低技术构建疾病相关细胞模型，为药物筛选和疗效评估提供有力的工具平台。
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