定位示踪
细胞是一个高度有序的结构,细胞内根据不同功能和空间分布可分为若干细胞器或区域,包括细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和细胞膜等。蛋白质在核糖体中合成后,会根据其分选信号被运送到特定的细胞器中,部分蛋白质则被分泌到细胞外或留在细胞质中。只有在正确的位置,蛋白质才能发挥其功能,参与细胞内的各种生命活动。因此,蛋白质的亚细胞定位研究具有重要意义。
亚细胞定位亚细胞定位研究旨在确定生物大分子在细胞内的具体位置,如细胞核、细胞质或细胞膜。蛋白质在细胞质中合成后,通过分选信号被导向特定的亚细胞结构,以参与多种生命活动。该研究对理解细胞功能、信号传导、代谢过程及疾病机制等至关重要。
应用领域
疾病研究:通过研究亚细胞定位的变化,揭示疾病的发生机制,如癌症和神经退行性疾病等。
药物开发:了解药物在细胞内的分布及作用机制,为药物设计提供依据。
研究方法
免疫荧光法
直接法:将标记有荧光的特异性抗体直接添加到抗原样本上,染色后去除未结合的反应,然后去除未反应的抗体,再加入带荧光标记的抗抗体(第二抗体)与样本反应,形成抗体-抗原-抗体复合物。最后洗去未结合的标记抗体,封片后镜检。如果检测未知抗体,则样本中的抗原已知,而第一抗体为待检血清。
融合报告基因法
通过将目标蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡萄糖苷酸酶(GUS)等报告基因融合,由目标蛋白的导向信号进行亚细胞定位。利用报告蛋白的荧光信号可以追踪目标蛋白的定位,是目前应用最广泛的蛋白质亚细胞定位方法。
生物信息学预测法
细胞器具有不同的理化特征,决定了它们对蛋白质的选择性。蛋白质表面暴露的理化特征是其亚细胞定位的重要依据,因此通过分析蛋白质的氨基酸组成可以预测其亚细胞定位。
亚细胞结构分离定位法
通过超速离心等技术分离各亚细胞结构,进一步提取其中的蛋白质进行分析,以确定其定位。该方法适合蛋白质组水平的细胞器定位研究,常与双向凝胶电泳和质谱技术结合使用。
慢病毒 | 线粒体定位慢病毒(mito-zsGreen/mcherry) |
慢病毒 | 核定位慢病毒(NLS-zsGreen/mcherry) |
慢病毒 | 微管定位慢病毒(tublin-GFP/cherry) |
慢病毒 | 自噬慢病毒GFP/RFP-LC3B |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒Luciferase-GFP-puro |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒GFP-Luciferase |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒Luciferase-puro |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒mCherry-Luciferase-Puro |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒Mcherry-Luciferase |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒Luciferase-Blasticidin |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒Luciferase--Neo |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒YFP-T2A-LucLuciferase |
慢病毒 | 荧光素酶慢病毒CFP-T2A-LucLuciferase |
慢病毒 | CAS9慢病毒Lenti-crispr-v2-NC |
慢病毒 | 绿色荧光慢病毒(Lenti-zsGreen/copGFP) |
慢病毒 | 红色荧光慢病毒(Lenti-cherry) |