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逆转录病毒

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一、概念
       
逆转录病毒是一种单链RNA病毒,能够将基因导入至多数处于增殖期的细胞中,由于导入基因可整合到染色体中,因此可以实现长期稳定的基因表达。重组逆转录病毒制备相对容易,但仍然需要在P2级实验室条件下操作。逆转录病毒载体是基于莫罗尼小鼠白血病病毒(MoMLV)开发的,在基因治疗方面有着丰富的应用实绩,也已被广泛应用于肿瘤和干细胞研究。

二、逆转录病毒表达载体
        野生型莫罗尼小鼠白血病病毒(MMLV)基因组约8.2 kb(包括两个LTR)。人工构建一个大于8.2 kb的基因组,同样也会导致产生不稳定的病毒粒子和病毒滴度的下降。与慢病毒表达载体相类似,大部分病毒基因组已被其他有用的序列(如筛选标记或荧光蛋白基因)取代,但仍有足够的空间用于克隆转基因。由于不同逆转录病毒表达载体包含的有用序列不同,因此用于克隆转基因的可用空间也不同。

三、逆转录病毒包装制备
       与慢病毒相似,重组逆转录病毒也会有产生RCL的可能性,所以逆转录病毒包装质粒也会进行特别设计。病毒包装用质粒上插入有逆转录病毒的结构基因,gag-pol和env基因,这两种基因是逆转录病毒构建和复制所必需的基因,但是质粒上缺少包装信号Ψ序列和LTR序列,因此包装用质粒本身是无法包装成逆转录病毒的,只有将其和包含Ψ序列和LTR序列的逆转录病毒表达载体共转染到293或者293T包装细胞中,才能包装得到逆转录病毒,产生具有自我复制能力逆转录病毒的几率也非常低。
       为方便使用,可以构建gagpol基因稳定表达细胞系,作为逆转录病毒包装细胞。这样将含有env基因的表达质粒和克隆了目标基因的表达载体共转染包装细胞,就可以制备出重组逆转录病毒了。这样的包装细胞系,有助于降低转染难度,提高成功率。

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