1、RNA提取

对于贴壁细胞样本

（1）用移液器小心吸去培养基，加入1mL 4℃预冷的PBS溶液，小心摇晃洗去残余培养基，用移液器吸尽PBS溶液，加入1mL Trizol溶液，反复吹打培养瓶/培养基底部及四周，将细胞充分吹打到Trizol中。加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。

（2）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。

（3）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。

对于悬浮细胞样本

（1）低速离心收集细胞，加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬，300g离心10 min，吸除上清。重复以上操作两次，收集细胞沉淀。加入1mL Trizol溶液，反复吹打将细胞充分吹打到Trizol中加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。

（2）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。

（3）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。

对于组织样本

（1）标本于-80℃或液氮中保存，用已经消毒的工具于冰上取约100mg组织，于1mL预冷的Trizol中充分研磨，匀浆液小心倒入1.5mL EP管中，加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。

（2）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。

（3）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。

对于血液样本

（1）取500μL全血于15mL离心管中，加入10倍体积红细胞裂解液，混匀，室温避光静置10min。

（2）室温，300g，离心10min，弃上清，重复步骤（1），室温，300g，离心10min，弃上清。

（3）PBS重悬细胞沉淀，室温，300g，离心10min，弃上清，100μL PBS重悬细胞，加入1mL Trizol，混匀，静置5min，加入250μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5min。

（4）混合液4℃，10000g，10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。

（5）溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75%乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。

2、第一链cDNA合成

第一链cDNA的合成采用M-MLV逆转录酶试剂盒进行（Invitrogen™公司），主要步骤如下：

（1）在冰上配置如下反应液

PCR仪上65℃5 min

冰上2 min

（2）在冰上配置如下反应液

PCR仪上37℃2 min

（3）在冰上配置如下反应液

PCR仪上37℃50 min

75℃15 min

4℃

3、荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是在Life technologies公司的StepOne™ Real-Time PCR仪上完成，每个样品均作3个复孔，使用SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒进行（TaKaRa公司）：

（1）反应程序为：预变性                          95℃，1min

循环（40次）           95℃，15s→58℃，20s→72℃，45s

熔解曲线                      60℃→95℃，每20s升温1℃

（2）反应体系为：