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◆ 自噬研究

自噬LC3双标腺病毒

自噬研究
专业自噬(Autophagy)研究服务
一、背景
 
概念:
 
目前根据发生过程分为三类:Macroautophagy,Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA), 大自噬(Macroautophagy)即我们说的自噬(autophagy);微自噬(Microautophagy):是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA):一些分子伴侣,如hsp70,能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy.
 
自噬是细胞内的一种“自食(Self-eating)”的现象,凋亡是“自杀(Self-killing)”的现象,二者共用相同的刺激因素和调节蛋白,但是诱发阈值和门槛不同,如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜(目前来源还有争议,大部分表现为双层膜,有时多层或单层)包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体(autophagosome),最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome),降解其所包裹的内容物,以实现细胞稳态和细胞器的更新。自噬的步骤可以大概总结为下面四步:
 
步骤1:细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构,然后不断扩张,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一个由2层脂双层组成的碗,可在电镜下观察到,被称为Phagophore,是自噬发生的铁证之一。
步骤2:Phagophore不断延伸,将胞浆中的任何成分,包括细胞器,全部揽入“碗”中,然后“收口”,成为密闭的球状的autophagosome,我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征:一是双层膜,二是内含胞浆成分,如线粒体、内质网碎片等。
步骤3:自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(这种情况不是必然要发生的)。
步骤4:自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,2者的内容物合为一体,自噬体中的“货物”也被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
 
二、自噬的研究方法:
 
典君生物已开发并完善了多套自噬相关的研究体系和工具,并积累了丰富的自噬研究经验。
 
正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,经报道的工具药有:
(一)自噬诱导剂
1)Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激
2)Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)
3)Earle's平衡盐溶液:制造饥饿
4)N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制剂
5)Rapamycin:mTOR抑制剂(这是最常用的)
6)Xestospongin B/C:IP3R阻滞剂
(二)自噬抑制剂
1)3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K)hVps34 抑制剂
2)Bafilomycin A1:质子泵抑制剂
3)Hydroxychloroquine(羟氯喹)
除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。
细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:
1)观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。(autophagic vacuole,AV)
2)在荧光显微镜下采用GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成:(常用)
     GFP-LC3单荧光指示体系:由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术:无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。典君生物已开发出高效的评价用GFP-LC3病毒载体,通过瞬时高效感染细胞,配合活细胞工作站成功评价自噬流。
 
mRFP-GFP-LC3双荧光指示体系:典君生物医药科技(上海)有限公司已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的质粒以及病毒产品。mRFP用于标记及追踪LC3,GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体,即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感,当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
 
我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱.
 
如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以及自噬流.
 
 
3)利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成:
自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
(Note:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)
 
4) 利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被认为是随机的,但是后来的研究表明有些蛋白是seletively降解的,在这些蛋白之中研究的最为透彻的是蛋白p62,p62 is selectively incorporated into autophagosomes through direct binding to LC3 and is efficiently degraded by autophagy ; thus, the total cellular expression levels of p62 inversely correlate with autophagic activity. (一般情况下p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系)

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