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◆ AAV 病毒使用操作手册

AAV 病毒使用操作手册
 

一、 AAV 病毒的储存与稀释:

1. 病毒的储存:收到病毒液后在很短时间内即使用 AAV 病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于 4 ℃保存;如需长期保存请放置于负 80℃冰箱保存(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口)
① 病毒可以存放于负 80℃冰箱 6 个月以上;但如果病毒储存时间超过 6 个月,建议在使用前重新测定病毒滴度。
② 反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度 10%左右;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装然后冻存。
2. 病毒的稀释:如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融化后,使用培养目的细胞用无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)或PBS 稀释。混匀分装后 4℃保存(请尽量在三天内用完) 或负 80 度冰箱冻存。
 

二、 AAV 病毒用于体外(In Vitro)实验:

感染培养原代细胞和建系细胞。AAV   病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同,在使用AAV 病毒之前可以通过查阅相关文献,了解 AAV 病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数(MOI 值) 以及在体内(In Vivo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持,可以通过感染预实验得到合适的感染复数(MOI  值)(使用 24 孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性)。
AAV 病毒感染目的细胞预实验
1. AAV 病毒感染目的细胞预实验注意事项:
① 测定 AAV 病毒对目的细胞的亲嗜性时,需要同时设置对AAV 病毒亲嗜性较高的细胞
(HEK293,Hela)作为平行实验的对照细胞。
② 在进行 AAV 病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用)稀释;理论上,含有血清,双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响AAV 病毒的感染效率。
③ 一般 AAV 病毒单位为 vg/ml,即每毫升病毒液中含有的病毒基因组拷贝数。如:病毒滴度为 1×1012 vg/ml 即每毫升病毒液中含有 1×1012 病毒基因组拷贝数。
2. 以 24 孔培养板为例,进行目的细胞和 HEK293 细胞的感染预实验前按照不同的 MOI 设置不同的感染孔,并根据 MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量,一般情况下 MOI 值从 105~106 之间,如有必要可以使用 PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
⑴ 第一天,准备细胞:在 24 孔培养板接种若干孔,每个孔内接种 3~5×104 个目的细胞,铺板时细胞的融合率为 50%左右,每孔培养基体积为 100 μl;进行病毒感染时细胞的融合度约为 70%左右。
⑵ 第二天,准备病毒:取出 4℃保存的病毒,用移液器混匀;如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照 MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中,并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积,以期获得最佳的感染效率。
⑶ 第二天,感染目的细胞:病毒准备好之后,从培养箱中拿出细胞,首先观察细胞生长状态, 如细胞状态较好则可以开始实验。
① 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。

② 吸去培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好,密度适宜,则不用换液)。
③ 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。
④ 混匀后置于二氧化碳培养箱(37℃、5% CO2)孵育过夜。
注意:感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,所以务必保证加病毒之前细胞 处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和 AAV 病毒的混合液直接加入培养器皿中。AAV 病毒对目的细胞的感染效率较低,通过提高 MOI 值可以提高病毒的感染效率。
⑷ 第三天,更换培养液:一般在 24 小时后将含有AAV 病毒的培养液更换成正常培养液,也可以不用换液,在感染后每天观察细胞生长状态。
⑸ 第六天,感染效率检测:在倒置荧光显微镜观察荧光,估计 AAV 病毒感染目的细胞的效率; 如果由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带 Marker Gene 的,可以通过 Real-time PCR 检测病毒的基因组拷贝数。

注意:

1. 有些 AAV 病毒载体上带有 GFP 绿色荧光蛋白,使用者可以在病毒感染 96 小时后使用倒置荧光显微镜观察 GFP 绿色荧光,以观察 AAV 病毒对目的细胞的感染情况。如果 AAV 病毒载体携带其他 Marker Gene 如RFP\BFP 可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况。
2. AAV 病毒表达时间较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染后 96 小时后观测荧光表达。感染后的细胞可以连续培养两周,通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定 AAV 病毒对目的细胞的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液,以保证细胞良好的生长状态。
 

三、 AAV 病毒用于动物实验:

(一)脑部注射

注射体积:小鼠不超过 2ul,大鼠不超过 5ul
操作方法:
1、脑室注射
大鼠:经腹腔注射 10%的水合氯醛(0.4g/kg 体重)麻醉后,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,向实验组大鼠第三脑室注射病毒,脑室立体定向坐标为:AP=-1mm,VD=4.5mm;微量注射器自脑表面垂直进针 2.6mm
小鼠:用 0.2mL0.4%戊巴比妥钠麻醉小鼠,将小鼠固定在定位仪上,剪开头顶部皮肤,酒精棉擦拭,暴露出前囟。采用右侧脑室定位,自前囟向后 2mm,矢状缝旁开 1.5mm处,即为侧脑室的体表部位。用微量注射器在此位置穿一小孔,深度为颅骨表面向下 2.5mm处, 快速恒速注射。
2、海马注射
大鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,于前囟后 3.0mm,中线右侧 2.0mm 处,微量注射器自脑表面垂直进针 2.8mm,向双侧海马缓慢注入,-20 度保存,,每侧注射时间5min, 留针 2min,缓慢退针。所有操作均在无菌条件下进行,皮肤切开处用青霉素抗菌,缝合伤口。
小鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,立体定向仪固定小鼠(bromega 2.3mm, L:1.8mm, V:2.0mm),根据所需注射部位,按小鼠脑立体定向定位,在钻孔后注射,速度 0.2ul/15 秒,注射完

毕后留针 2min,然后每分钟退针 1mm。整个注射过程不到 10min,注射效果好的话, 小鼠很快从麻醉(气体)中恢复。
注意事项:
I、固定头颅时一定要准确插入双耳固定棒,不能太紧,也不能靠颈部,这样容易刺激迷走神经而引起呼吸停止,难以抢救。
II、钻孔时一定要控制好,宁慢勿快,很容易在颅骨钻通后一不小心钻头进入脑组织。
III、麻醉很关键。腹腔注射剂量不好掌握,用多了小鼠死亡率很高,鼠在手术过程中稍有挣扎,就会对定位有影响,且对操作不利。
3、核团注射 操作方法:
小鼠:按照 50 mg/kg 给小鼠注射戊巴比妥钠进行麻醉,固定于脑立体定位仪上,按照AcbC (AP: +1.1 mm; ML: 1.0 mm; DV: 3.8 mm), the medial AcbSh (AP: +0.98 mm; ML: 0.5 mm; DV: 4.0 mm), and the ventral AcbSh (AP: +1.10 mm; ML: 1.0 mm; DV: 5.0 mm),分别钻孔并用外部尖端直径为 10-20um 的玻璃微量注射器进行压力注射。缓慢注射,要持续注射 15 分钟左右以使得病毒液可以在脑内可以较大范围分布,注射完后,留针
10 分钟,缓慢抽回注射器,缝合伤口。注意事项:
I、固定头颅时一定要准确。
II、钻孔时一定要控制好,宁慢勿快。III、要在无菌条件下操作。
4、VTA 区注射操作方法:
小鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,在(AP: 前囟-3.2 mm, L: 中间线+0.5 mm,DV:硬脑膜下 4.3mm) 插入探针钻孔,钻孔后注射,速度 1ul/min,注射完毕后,留针 10min,慢慢抽回注射器,除去套管,进行伤口缝合,进行进一步处理或者灌注前,需将注射后的小鼠单独培养 2 到 3 周。
大鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,于前囟后 4.7mm,中线右侧 1.6mm 处,微量注射器自脑表面垂直进针 8mm,插入探针钻孔,钻孔后注射,插入探针钻孔,钻孔后注射,速度 1ul/min,注射完毕后,留针 5min,慢慢抽回注射器,除去套管,进行伤口缝合,进行进一步处理或者灌注前,需将注射后的小鼠单独培养 2 到 3 周。
注意事项:
I、所有操作要在无菌条件下进行;
II、使用 500nl Hamilton 注射器进行注射;

(二)尾静脉注射

每只小鼠病毒注射量:
以下为建议,具体的注射量需要实验摸索
纯化过的 AAV 病毒:5~10×1010vg 病毒量注射,比如纯化 AAV 病毒滴度为 1×1012vg/ml,则每只小鼠注射体积约为 50~100ul。
每只小鼠病毒注射体积:
注射体积不要超过 200ul,最好控制在 100ul 以下,注射剂量过多,也会发生充血性心衰。关于注射针:一般小鼠尾静脉注射可采用 1ml 注射器,并更换为 4 号针头。

 

四、 AAV 病毒安全使用规范:

1. 病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风机。
2. 病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。
3. 操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用
70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请于 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡过夜后弃去。
4. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。用 70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用 70%乙醇清理显微镜实验台。5.如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽量使用组织培养室内的离心机。
6.脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。
 

四、悬浮细胞感染方法概要:

1. 根据细胞的量将细胞在 15ml 管中离心收集,然后用 1~2ml 的无血清培养液稀释细胞沉淀, 以细胞完全浸没在培养基中为准。
2. 按照 MOI 换算病毒颗粒数量,吸取病毒液加入细胞中,将 15ml 离心管置入水平离心机
1000rpm 低速离心 1 小时,然后再放入 37℃,CO2 培养箱中孵育 2~3 小时。
3. 将离心管中混合液体吸出加到培养皿或培养瓶中。
4. 加入足够量的新鲜培养液。
5. 96 小时后观察细胞阳性率。
 

五、 相关专业术语:

MOI:病毒感染复数传统的 MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为 pfu。一般认为 MOI 是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是 pfu  number/cell。后来 MOI 被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量的比值,本手册中提到的 MOI 都是沿用这个概念。然而, 由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使 MOI 产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用 pfu 表示病毒数量,因此其 MOI 的含义与传统的概念相同。

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