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逆转录病毒操作说明

逆转录病毒产品说明书
 
 
 
 
逆转录病毒的储存与稀释
 
 
➢ 储存:收到逆转录病毒液后,请于-80℃或者更低的环境中储存,保质期一年。如需多次使用,请分装后存放,避免反复冻融次数,以免降低病毒活力。超过此期限后,为保证使用效果,建议重新检测病毒滴度。
 
➢ 融化与稀释:病毒使用时,请将病毒从-80℃冰箱取出,冰浴融化。如需稀释,可用 PBS 缓冲液或新鲜培养基稀释,现配现用。
 
 
 
 
 
 
 
 
逆转录病毒安全使用注意事项
 
 
➢ 病毒操作时请穿好实验服,戴好手套、口罩和帽子之后再进行后续实验。
 
➢ 病毒操作时建议使用生物安全柜(如果使用普通超净台,请不要打开排风机)
 
➢ 实验过程中,尽量避免产生气雾或飞溅。如果台面有病毒污染,请立即用 84 消毒液擦拭干净。
 
➢ 如实验过程中需要离心,应使用密闭性较好的离心管,用封口膜封口后再进行下一步操作。
 
➢ 废弃物用 84 消毒液(1:20)浸泡过夜,或高压灭菌。
 
➢ 实验结束后,用肥皂或洗手液清洗双手。
 
 
 
 
 
 
 

 
逆转录病毒包装体系简介
 
典君生物采用三质粒逆转录病毒包装系统,组成为:pCL-ECO 或 VSVG+gagpol 与 pNHRV 系列质粒,是目前科研和细胞治疗中最稳定的逆转录病毒系统。
 
 
逆转录病毒生产流程
 
➢ step 1 逆转录病毒质粒构建及大量抽提
 
➢ step 2 逆转录病毒骨架质粒与包装质粒共转染 293T 细胞
 
➢ step 3 病毒收集与浓缩
 
➢ step 4 滴度测定
 
 
 
 
感染目的细胞
 
细胞准备
 
感染病毒前,将细胞状态调整至最佳,接种到 24 孔板或 6 孔板,使细胞密度约为1*105/ml。接种细胞数量因细胞大小和生长速度而略有不同,请根据实际情况进行调整,使第二天进行病毒感染时细胞汇合率在 60%左右。
 
病毒感染
 
细胞最佳 MOI 的测定
 
MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)是指每个细胞感染所需的病毒颗粒数。对于分裂旺盛的细胞,例如 293、Hela 细胞,MOI=1~10 时,80%以上的细胞均可以感染上。而对于一
 
些分裂能力低的细胞或者终末端分化细胞,例如原代细胞,感染效率较低时,需要通过设置 MOI 梯度,测定细胞的最适 MOI 值,选择合适的 MOI 后仔进行后续实验。
 
感染操作步骤
 
1. 细胞铺板(推荐 24 孔板或 6 孔板),细胞数以第二天感染时密度为 60%左右为宜,最佳培养条件培养过夜。
 
2. 感染前,从冰箱取出病毒置于冰上,满满融化。待病毒完全融化,根据 MOI 值,计算加入病毒的体积。轻轻摇晃 3~5 次,将病毒液和培养基混匀,放回培养箱。
 
3. 计算公式:加入病毒量(ul)= 细胞数*MOI/病毒滴度*1000
 
4. 感染后 10~24h 之内,吸走含病毒的培养液,换上新鲜培养基,放回培养箱继续培养。
 
5. 感染 48 后,对于带荧光蛋白基因(如 GFP、RFP)的病毒,可通过荧光显微镜观察荧光蛋白表达效率。对于携带真核抗性基因(如 puromycin)的病毒,换上含有适当浓度抗生素生物新鲜培养基,可进一步筛选稳定转导特定基因的细胞株。
 
6. 稳定细胞株筛选(以 puromycin 抗性筛选为例)
 
puromycin 推荐使用浓度为 1~10ug/ml,但不同细胞所需的工作浓度不同,可查阅相关文献,并设置空白对照组(未感染病毒的野生型细胞),加入等量的 puromycin。
 
每 2~3 天更换一次含有抗生素的完全培养基,直至空白对照组细胞全部被 puromycin 杀死。
 
将感染并筛选侯的细胞进行传代,并继续施加 puromycin 维持筛选培养。连续传代 3~5 代后,冻存保种细胞。
 
 
提高感染效率的办法
 
1. 助转剂 Polybrene
 
Polybrene 可增加 5~10 倍感染效率,是最常用的助转剂,但其本身具有一定的细胞毒性,剂量不可太大,一般 4~8ug/ml 即可。如若不确定目的细胞是否可以使用 Polybrene,建议做预实验观测细胞状态。
 
2. 感染悬浮细胞
 
悬浮细胞或半悬浮细胞是较为难感染的细胞,一般除了加入 polybrene 外,还需要离心感染。将装有 细胞-培养基-病毒 混合液的培养板密封,用胶带固定好培养平板,并用保鲜膜包裹严实后,置于平角离心机中离心感染,1800rpm,2h。放回培养箱培养。
 
3. 对于极难感染的细胞
 
可以尝试逆转录病毒多次感染、使用高滴度逆转录病毒或采用其他病毒产品,或可显著提升感染效率。
 
 
 
 

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