逆转录病毒操作说明

逆转录病毒产品说明书

逆转录病毒的储存与稀释

➢ 储存：收到逆转录病毒液后，请于-80℃或者更低的环境中储存，保质期一年。如需多次使用，请分装后存放，避免反复冻融次数，以免降低病毒活力。超过此期限后，为保证使用效果，建议重新检测病毒滴度。

➢ 融化与稀释：病毒使用时，请将病毒从-80℃冰箱取出，冰浴融化。如需稀释，可用 PBS 缓冲液或新鲜培养基稀释，现配现用。

逆转录病毒安全使用注意事项

➢ 病毒操作时请穿好实验服，戴好手套、口罩和帽子之后再进行后续实验。

➢ 病毒操作时建议使用生物安全柜（如果使用普通超净台，请不要打开排风机）

➢ 实验过程中，尽量避免产生气雾或飞溅。如果台面有病毒污染，请立即用 84 消毒液擦拭干净。

➢ 如实验过程中需要离心，应使用密闭性较好的离心管，用封口膜封口后再进行下一步操作。

➢ 废弃物用 84 消毒液（1:20）浸泡过夜，或高压灭菌。

➢ 实验结束后，用肥皂或洗手液清洗双手。

逆转录病毒包装体系简介

典君生物采用三质粒逆转录病毒包装系统，组成为：pCL-ECO 或 VSVG+gagpol 与 pNHRV 系列质粒，是目前科研和细胞治疗中最稳定的逆转录病毒系统。

逆转录病毒生产流程

➢ step 1 逆转录病毒质粒构建及大量抽提

➢ step 2 逆转录病毒骨架质粒与包装质粒共转染 293T 细胞

➢ step 3 病毒收集与浓缩

➢ step 4 滴度测定

感染目的细胞

细胞准备

感染病毒前，将细胞状态调整至最佳，接种到 24 孔板或 6 孔板，使细胞密度约为1*10⁵/ml。接种细胞数量因细胞大小和生长速度而略有不同，请根据实际情况进行调整，使第二天进行病毒感染时细胞汇合率在 60%左右。

病毒感染

细胞最佳 MOI 的测定

MOI（Multiplicity of Infection,感染复数）是指每个细胞感染所需的病毒颗粒数。对于分裂旺盛的细胞，例如 293、Hela 细胞，MOI=1~10 时，80%以上的细胞均可以感染上。而对于一

些分裂能力低的细胞或者终末端分化细胞，例如原代细胞，感染效率较低时，需要通过设置 MOI 梯度，测定细胞的最适 MOI 值，选择合适的 MOI 后仔进行后续实验。

感染操作步骤

1. 细胞铺板（推荐 24 孔板或 6 孔板），细胞数以第二天感染时密度为 60%左右为宜，最佳培养条件培养过夜。

2. 感染前，从冰箱取出病毒置于冰上，满满融化。待病毒完全融化，根据 MOI 值，计算加入病毒的体积。轻轻摇晃 3~5 次，将病毒液和培养基混匀，放回培养箱。

3. 计算公式：加入病毒量（ul）= 细胞数*MOI/病毒滴度*1000

4. 感染后 10~24h 之内，吸走含病毒的培养液，换上新鲜培养基，放回培养箱继续培养。

5. 感染 48 后，对于带荧光蛋白基因（如 GFP、RFP）的病毒，可通过荧光显微镜观察荧光蛋白表达效率。对于携带真核抗性基因（如 puromycin）的病毒，换上含有适当浓度抗生素生物新鲜培养基，可进一步筛选稳定转导特定基因的细胞株。

6. 稳定细胞株筛选（以 puromycin 抗性筛选为例）

puromycin 推荐使用浓度为 1~10ug/ml，但不同细胞所需的工作浓度不同，可查阅相关文献，并设置空白对照组（未感染病毒的野生型细胞），加入等量的 puromycin。

每 2~3 天更换一次含有抗生素的完全培养基，直至空白对照组细胞全部被 puromycin 杀死。

将感染并筛选侯的细胞进行传代，并继续施加 puromycin 维持筛选培养。连续传代 3~5 代后，冻存保种细胞。

提高感染效率的办法

1. 助转剂 Polybrene

Polybrene 可增加 5~10 倍感染效率，是最常用的助转剂，但其本身具有一定的细胞毒性，剂量不可太大，一般 4~8ug/ml 即可。如若不确定目的细胞是否可以使用 Polybrene，建议做预实验观测细胞状态。

2. 感染悬浮细胞

悬浮细胞或半悬浮细胞是较为难感染的细胞，一般除了加入 polybrene 外，还需要离心感染。将装有细胞-培养基-病毒混合液的培养板密封，用胶带固定好培养平板，并用保鲜膜包裹严实后，置于平角离心机中离心感染，1800rpm，2h。放回培养箱培养。

3. 对于极难感染的细胞

可以尝试逆转录病毒多次感染、使用高滴度逆转录病毒或采用其他病毒产品，或可显著提升感染效率。

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