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◆ 腺病毒使用操作手册


 
腺病毒使用操作手册
 
 
 
 
一、 腺病毒的储存与稀释:
 
1. 病毒的储存:收到病毒液后在很短时间内即使用腺病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于 4 ℃ 保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口)
① 病毒可以存放于-80℃ 6 个月以上;但如果病毒储存时间超过 6 个月,建议在使用前需要重新测定病毒滴度。
 
② 反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度 10%;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
 
2. 病毒的稀释:如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用培养目的细胞用 PBS 或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后 4℃保存(请尽量在三天内用完)分装后使用。
 
二、 腺病毒用于体外(In Vitro)实验:
 
感染培养原代细胞和建系细胞,腺病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同,在使用腺病毒之前可以通过查阅相关文献,了解腺病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数(MOI 值)以及在体内(In Vivo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持,可以通过感染预实验得到合适的感染复数(MOI 值)(使用 24 孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性)。
腺病毒感染目的细胞预实验
 
1. 腺病毒感染目的细胞预实验注意事项:
 
① 测定腺病毒对目的细胞的亲嗜性时,需要同时设置对腺病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293,Hela)作为平行实验的对照细胞。
 
② 在进行腺病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用)稀释;理论上,含有血清,双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响腺病毒的感染效率。
 
③ 一般腺病毒单位为 pfu/ml,即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如:病毒滴度为>1×1010pfu/ml 即每毫升病毒液中至少含有 1×1010 个具有生物活性的腺病毒颗粒。
 
2. 以 96 孔培养板为例,进行目的细胞和 HEK293 细胞的感染预实验前按照不同的 MOI 设置不同的感染孔,并根据 MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量,如有必要可以使用 PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
 
⑴ 第一天,准备细胞:在 96 孔培养板接种若干孔,每个孔内接种 3~5×104 个目的细胞,铺板时细胞的融合率为 50%左右,每孔培养基体积为 100 μl;进行病毒感染时细胞的融合度约为 70% 左右。
 
⑵ 第二天,准备病毒:取出 4℃保存的病毒,使用台式离心机离心 20 秒(使病毒完全悬于离心管底部即可);如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照 MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中,并尽可能保证所获得的含有腺病毒的培养基的总体积为最小体积,以期获得最佳的感染效率。
 
⑶ 第二天,感染目的细胞:病毒准备好之后,从培养箱中拿出细胞,首先观察细胞生长状态,如细胞状态较好则可以开始实验。
 
① 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。
 
② 吸去培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好,密度适宜,则不用换液)。

 
 

 
③ 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。
 
④ 混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃、5% CO2)孵育过夜。
 
注意:感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和腺病毒的混合液直接加入培养器皿中。腺病毒对目的细胞的感染效率较低,通过提高 MOI 值可以提高病毒的感染效率。
 
⑷ 第三天,更换培养液:一般在 24 小时后将含有腺病毒的培养液更换成正常培养液;在感染后观察细胞状态,如果腺病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态,可以最短在加病毒 4 小时候更换新鲜培养液后继续培养(建议在 8-12 小时更换为宜)。第一次换液后,如果腺病毒对细胞没有明显毒性作用,按照正常培养条件培养换液。
 
⑸ 第四天,感染效率检测:在倒置荧光显微镜观察荧光,估计腺病毒感染目的细胞的效率;如果由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带 Marker Gene 的,可以通过 RT-PCR 检测目的基因的表达来评估感染效率。
 
注意:
 
1. 有些腺病毒载体上带有 GFP 绿色荧光蛋白,使用者可以在病毒感染 96 小时后用倒置荧光显微镜观察 GFP 绿色荧光,以观察病毒对目的细胞的感染情况。如果腺病毒载体携带其他 Marker Gene 如 RFP\BFP 可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况。
2. 建议感染后 48 小时后观测荧光表达,通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定腺病毒对目的细胞的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液,以保证细胞良好的生长状态。
 
三、 腺病毒用于动物实验:
 
(一)脑部注射
 
注射体积:小鼠不超过 2ul,大鼠不超过 5ul 操作方法:
 
1、脑室注射
 
大鼠:经腹腔注射 10%的水合氯醛(0.4g/kg 体重)麻醉后,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,向实验组大鼠第三脑室注射病毒,脑室立体定向坐标为:AP=-1mm,VD=4.5mm;微量注射器自脑表面垂直进
 
针 2.6mm
 
小鼠:用 0.2mL0.4%戊巴比妥钠麻醉小鼠,将小鼠固定在定位仪上,剪开头顶部皮肤,酒精棉擦拭,暴露出前囟。采用右侧脑室定位,自前囟向后 2mm,矢状缝旁开 1.5mm处,即为侧脑室的体表部位。用微量注射器在此位置穿一小孔,深度为颅骨表面向下 2.5mm处,快速恒速注射。
 
2、海马注射
 
大鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,于前囟后 3.0mm,中线右侧 2.0mm 处,微量注射器自脑表面垂直进针2.8mm,向双侧海马缓慢注入,-20 度保存,,每侧注射时间5min, 留针2min,缓慢退针。所有操作均在无菌条件下进行,皮肤切开处用青霉素抗菌,缝合伤口。
 
小鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,立体定向仪固定小鼠(bromega 2.3mm, L:1.8mm, V:2.0mm),根据所需注射部位,按小鼠脑立体定向定位,在钻孔后注射,速度 0.2ul/15 秒,注射完毕后留针 2min,然后每分钟退针 1mm。整个注射过程不到 10min,注射效果好的话,小鼠很快从麻醉(气体)中恢复。
 
注意事项:

 
 

 
I、固定头颅时一定要准确插入双耳固定棒,不能太紧,也不能靠颈部,这样容易刺激迷走神经
 
而引起呼吸停止,难以抢救。II、钻孔时一定要控制好,宁慢勿快,很容易在颅骨钻通后一不小心钻头进入脑组织。III、麻醉很关键。腹腔注射剂量不好掌握,用多了小鼠死亡率很高,鼠在手术过程中稍有挣扎,
 
就会对定位有影响,且对操作不利。3、核团注射操作方法:
 
小鼠:按照 50 mg/kg 给小鼠注射戊巴比妥钠进行麻醉,固定于脑立体定位仪上,按照 AcbC (AP: +1.1 mm; ML: 1.0 mm; DV: 3.8 mm), the medial AcbSh (AP: +0.98 mm; ML: 0.5 mm; DV: 4.0 mm), and the ventral AcbSh (AP: +1.10 mm; ML: 1.0 mm; DV: 5.0 mm),分别钻孔并用外部尖端直径为 10-20um 的玻璃微量注射器进行压力注射。缓慢注射,要持续注射 15 分钟左右以使得病毒液可以在脑内可以较大范围分布,注射完后,留针 10 分钟,缓慢抽回注射器,缝合伤口。
 
注意事项:I、固定头颅时一定要准确。II、钻孔时一定要控制好,宁慢勿快。III、要在无菌条件下操作。
 
4、VTA 区注射
 
操作方法:
 
小鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,在(AP: 前囟-3.2 mm, L: 中间线+0.5 mm,DV:硬脑膜下 4.3mm)插入探针钻孔,钻孔后注射,速度 1ul/min,注射完毕后,留针 10min,慢慢抽回注射器,除去套管,进行伤口缝合,进行进一步处理或者灌注前,需将注射后的小鼠单独培养 2 到 3 周。
 
大鼠:1%戊巴比妥钠麻醉,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,于前囟后 4.7mm,中线右侧 1.6mm 处,微量注射器自脑表面垂直进针 8mm,插入探针钻孔,钻孔后注射,插入探针钻孔,钻孔后注射,速度 1ul/min, 注射完毕后,留针 5min,慢慢抽回注射器,除去套管,进行伤口缝合,进行进一步处理或者灌注前,需将注射后的小鼠单独培养 2 到 3 周。
注意事项:
 
I、所有操作要在无菌条件下进行;
 
II、使用 500nl Hamilton 注射器进行注射;
 
(二)尾静脉注射
 
每只小鼠病毒注射量:
 
以下为建议,具体的注射量需要实验摸索纯化过的腺病毒:5~10×108pfu 病毒量注射,比如纯化腺病毒滴度为 1×1010pfu/ml,则每只小鼠注射体积约为 50~100ul。
 
每只小鼠病毒注射体积:
 
注射体积不要超过 200ul,最好控制在 100ul 以下,注射剂量过多,也会发生充血性心衰。关于注射针:一般小鼠尾静脉注射可采用 1ml 注射器,并更换为 4 号针头。
 
四、 腺病毒安全使用规范:
 
1.病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风机。
 
2.病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。

 

 
3.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用
 
70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请于 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡过夜后弃去。4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。用 70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用 70%乙醇清理显微镜实验台。5.如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽量使用组织培养室内的离心机。
 
6.脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。
 
四、悬浮细胞感染方法概要:
 
1. 根据细胞的量将细胞在 1.5ml 管中离心收集然后用 100-200μl 的无血清培养液稀释细胞沉淀,以细胞完全浸没在培养基中为准。
 
2. 按照 MOI 换算病毒颗粒数量,吸取病毒液加入细胞中,将 1.5ml 管放在 37℃度培养箱中孵育 30 分钟。
3. 将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里。
 
4. 加入足够量的新鲜培养液。
 
5. 12 小时后换液。
 
6. 96 小时后观察细胞阳性率。
 
五、 相关专业术语:
 
MOI:病毒感染复数传统的 MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
 
噬菌体的数量单位为 pfu。一般认为 MOI 是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是 pfu number/cell。后来 MOI 被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是
 
感染时病毒与细胞数量的比值,本手册中提到的 MOI 都是沿用这个概念。然而,由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使 MOI 产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用 pfu 表示病毒数量,因此其 MOI 的含义与传统的概念相同。
 
六、 细胞培养器皿的相关参数:
 
Flask/Dish Surface (mm2) Cell number Media Volume
96 well plate 50 1.5-5.0×104 100 μl
48 well plate 100 3.0×104-1.0×105 200 μl
24 well plate 200 8.0×104-2.0×105 500 μl
12 well plate 401 1.6-4.0×105 1.0 ml
6 well plate 962 3.0-8.0×105 2.0 ml
35mm 962 3.0-8.0×105 2.0 ml
60mm 2827 1.0-2.5×106 6.0 ml
100mm 7854 2.5-6.4×106 10.0 ml

 
 
 
 
 
 

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