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◆慢病毒使用操作说明

 
慢病毒使用操作说明
 
一、 慢病毒的储存与稀释:
 
1. 病毒的储存:收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于 4 ℃ 保存;如需长期保存请放置于负 80℃冰箱(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口)
① 病毒可以存放于负 80℃ 冰箱 6 个月以上;但如果病毒储存时间超过 6 个月,建议在使用前重新测定病毒滴度。
 
② 反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度 10%左右;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装然后冻存。
 
2. 病毒的稀释:如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用培养目的细胞用无血清培养基或 PBS 来稀释。混匀分装后 4℃短期保存(请尽量在三天内用完) 或负 80 度冰箱长期保存。
 
二、 慢病毒用于细胞实验步骤:
 
感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同,在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献,了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数(MOI 值)以及在体内(In Vivo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持,可以通过感染预实验得到合适的感染复数(MOI 值)(使用 24 孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性)。
慢病毒感染目的细胞预实验
 
1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项:
 
① 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时,需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293,Hela)作为平行实验的对照细胞。
 
② 在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用)稀释;理论上,含有血清,双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
 
③ 一般慢病毒单位为 TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如:病毒滴度为 1×108 TU/ml 即每毫升病毒液中含有 1×108 个具有生物活性的慢病毒颗粒。
 
2. 以 24 孔培养板为例,进行目的细胞和 HEK293 细胞的感染预实验前按照不同的 MOI 设置不同的感染孔,并根据 MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量,如有必要可以使用 PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
 
⑴ 第一天,准备细胞:在 24 孔培养板接种若干孔,每个孔内接种 3~5×104 个目的细胞,铺板时细胞的融合率为 50%左右,每孔培养基体积为 100 μl;进行病毒感染时细胞的融合度约为 70% 左右。
 
⑵ 第二天,准备病毒:取出 4℃保存的病毒,用移液器混匀;如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照 MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中,并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积,以期获得最佳的感染效率。
 
⑶ 感染目的细胞:病毒准备好之后,从培养箱中拿出细胞,首先观察细胞生长状态,如细胞状态较好则可以开始实验。
 
① 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基中。
 
② 吸去培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好,密度适宜,则不用换液)。
 
③ 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。
④ 混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃、5% CO2)孵育过夜。

 
 
 

 
 
注意:感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中。如果慢病毒对目的细胞的感染效率较低,可以通过提高 MOI 值可以提高病毒的感染效率,但是当 MOI 高于 20 时,我们建议在培养基中加入 polybrene(5-10 μg/ml 左右)来提高病毒的感染效率。
 
⑷ 第三天(即加入病毒 24 小时后),吸去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液,继续 37℃ 培箱培养。
 
⑸ 第四天(即加入病毒 48 小时后),对于带 GFP 报告基因的病毒,可通过荧光显微镜观测 GFP 表达效率,对于携带 Puromycin 抗性基因的病毒,换上含适当浓度的 Puromycin 的新鲜完全培养液,筛选稳定表达的细胞株。
 
⑹ Puromycin 抗性筛选:
 
Puromycin 标准的施加终浓度范围为 1~10μg/ml,不同细胞 puromycin 的工作浓度不同,请查找相关文献(部分细胞参考用量见下图),另外请设不感染筛选对照(未经过病毒感染的野生型细胞),加入等量等浓度的 puromycin。
 
部分细胞 puromycin 参考值
 
Cell line Species Puromycin (µg/ml)
     
293 Human 3
     
HeLa Human 3
     
B16 Mouse 1-3
     
PC1.0 Hamster 10
     
MC3T3-E1 Mouse 10
     
H9C2 Rat 1
     
MCF-7 Human 1-3
     
MDA-MB-××× Human 1-3
     
HepG2 Human 2
     
HT1080 Human 1
     
A549 Human 1.5
     
H1299 Human 2
     
Human embroyonic stem cell Human 1
s(Human ESCs)
   
     
 
每 2-3 天更换含 puromycin 的完全培养液一次,至不感染筛选对照组细胞被 puromycin 杀光为止。

 

 
 
 
 
⑺ 多克隆细胞株筛选:
 
将感染并筛选后的细胞进行传代,并继续施加 puromycin 进行维持性筛选培养,连续筛选并传 3 代后,冻存保存稳定表达细胞株。
⑻ 单克隆细胞株筛选:
 
将感染并筛选后的细胞挑选至少 5 个单克隆进行细胞扩增,,并继续施加 puromycin 进行维持抗性筛选培养。扩增完毕后 westernblot 或者 Q-PCR 检测目的蛋白的表达。挑取表达适中的稳定细胞株,连续筛选并传 3 代后,冻存保存稳定表达细胞株。
 
三、 慢病毒安全使用规范:
 
慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒因此没有毒性作用。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险,不建议使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性,否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。使用时请参照如下所示进行实验:
 
1.病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风机。
 
2.病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。
 
3.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用
 
70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请于 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡过夜后弃去。4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。用 70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用 70%乙醇清理显微镜实验台。5.如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽量使用组织培养室内的离心机。
 
6.脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。
 
四、悬浮细胞感染方法:
 
1. 根据细胞的量将细胞在 15ml 管中离心收集,然后用 1-2ml 的无血清培养液稀释细胞沉淀,以细胞完全浸没在培养基中为准。
 
2. 按照 MOI 换算病毒颗粒数量,吸取病毒液加入细胞中,将 15ml 离心管置入水平离心机 1000rpm 低速离心 1 小时,然后再放入 37℃度 CO2 培养箱中孵育 2 小时。
3. 将离心管中混合液体吸出加到培养皿或培养瓶中。
 
4. 加入足够量的新鲜培养液。
 
5. 12 小时后换液。
 
6. 96 小时后观察细胞阳性率。
 
五、 相关专业术语:
 
MOI:病毒感染复数传统的 MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为 pf u。一般认为 MOI 是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是 pfu number/cell。后来 MO I 被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量的比值,本手册中提到的 MOI 都是沿用这个概念。然而,由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使 MOI 产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用 pfu 表示病毒数量,因此其 MOI 的含义与传统的概念相同。

 
 

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