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常见问题

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◆ 分子操作出现的问题

质粒的提取中常出现的问题
1、 质粒提取不成功的原因
(1) 裂解时间太长。加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
(2) 吸附时间不够
(3) 溶解时间不够
(4) 大肠杆菌老化。建议涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。
(5) 质粒拷贝数低。由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
(6) 菌体中无质粒。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。碱裂解不充分。使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒,提取时,可加倍使用溶液P1、P2和P3,可能有助于增加质粒提取量和质料质量。
(7) 溶液使用不当。溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。
(8) 吸附柱过载。不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如TB或者×YT,菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率,则需调整LB培养液体积。
(9) 质粒未全部溶解。洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
(10) 乙醇残留。漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。
(11) 洗脱液加入位置不正确。洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
(12) 洗脱液不合适。DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB(10 mM Tris•Cl, pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0~8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
(13) 洗脱体积太小。洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
(14) 混有蛋白。不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物,可再次离心去除后再进行下一步骤。
 
DNA电泳中常出现的问题
1、 提大肠杆菌质粒后跑琼脂糖凝胶电泳无条带出现
在确定琼脂糖凝胶电泳无问题的前提下,那应该就是质粒提取有问题。首先看质粒是高拷贝还是低拷贝的质粒,一般低拷贝的质粒5ml的,高拷贝的质粒2-3ml小剂量提取。量不能过大,否则影响提取。第二点,加入裂解液如SDS-NaOH后,时间不宜超过5min,因为此步骤的目的是使细胞内物质释放,蛋白质,染色体DNA和质粒DNA变性,时间过长,会导致加入中和裂解液如酸性醋酸钾后,仍无法使质粒DNA复性。导致提取失败。
2、 电泳无条带的原因
(1) 上样量太小。解决方案是增加上样量。
(2) 样品分子量不在胶允许范围内。建议另外配置合适的胶。
(3) 提取不干净或缓冲液有问题。
(4) 菌的问题,菌种是否正确,有没有确信加了抗生素,质粒拷贝数高不高,菌量够不够然后提取的时候,试剂盒牌子质量过不过硬,有没有过期,裂解是不是完全,会不会SDS或者高盐都结晶沉淀了,所有溶液有没有加错,比如说柱分离,漂洗液里面有没有确信加了酒精,洗脱时候洗脱液假如用的是纯水,有没有调过pH值,加的量够不够,有没有完全浸润硅胶膜。
(5) 最后跑电泳的时候,有没有确信加了EB,加的样品量有多少,有没有增加样品量看看。
3、 marker条带非常模糊,无法辨别具体条带的原因
(1)marker条带出现了降解。请确保在使用过程中避免核酸酶污染;
(2)电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后,离子浓度降低,ph值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果,建议经常更换电泳缓冲液;
(3)电泳条件不合适。电泳时电压应不超过20v/cm,温度应低于30℃;
(4) marker上样量过多。请根据说明书选用合适上样量;
(5)凝胶质量不好。建议使用质量较好的琼脂糖;此外,凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。
 
DNA回收中常出现的问题
1、 没有回收到 DNA片段
如在洗脱后,发现洗脱液中没有DNA 片段,请检查是否按瓶身标签,在洗涤液中加
入了无水乙醇.
 2、提取率低
(1) 融胶液为酸性缓冲液,如融胶后,其 pH 值升高将影响提取得率.请加入 0.1 倍体积
的 3M 乙酸钾(pH5.0).
(2) 长时间使用后没有更换的电泳缓冲液,其 pH 值较高,将影响DNA 的吸附.请更换新
的电泳缓冲液后,再进行电泳,然后切胶.
(3) 在洗脱前,将洗脱液于 30~60℃温浴,可提高提取效率.
3、回收得片段为什么电泳上样会漂起来?
主要问题是纯化过程中的乙醇没有除干净。
4、 胶很难融如何处理?
将融胶问题提高到60度;可能是胶的浓度太高,需要提高融胶液的体积;融胶过程中每隔一段时间就震荡几下帮助融胶。
5、如果胶在后续过程发生胶没有彻底融化,如何补救?
补加融胶液,将胶悬起来,50-60度继续保温至彻底融化。
6、如果DNA纯化的得率非常低或根本没有,估计是什么问题?
一点都不能得到产物的回收情况很少见,有些情况是判定回收效率的方式不对。如对,请检查一下Wash中有没有加入酒精;检查加入的DNA结合剂(Solution S或Solution SN)的量对不对;洗脱前有没有将残留得酒精去彻底;洗脱液有没有使吸附材料充分接触(洗脱),接触的时间是否充分。
7、用Ez-Resin如果凉干过头,如何处理?
答:加TE, 50-60度处理10分钟,间或振荡,离心收集上清。
 
外源质粒对大肠杆菌的转化中常出现的问题
1、大肠杆菌经质粒转化后铺板生长菌落大小不一
转入空载质粒、含有插入的DNA片断、以及少量具有抗性的菌落在选择培养基上受到的选择压不同,生长速率不一。
2、 没有或极少量菌落
(1) 感受态细胞效率低:使用转化效率高于 107 cfu/mg 的感受态
(2)PCR产物量不足:电泳定量,浓缩PCR产物
(3) 抗生素用错或浓度过高
 
 

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