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◆ 慢病毒包装常见问题

慢病毒包装技术专题
 
1.慢病毒载体 可以插入多大的目的片段?
 
答:慢病毒载体 的载量为4-5.5kb左右(还取决于载体本身是否有其他抗性基因或报告基因)。一般而言插入的片段如果在3kb以下产生的病毒滴度比较高,当插入的片段大于4kb的时候得到的病毒滴度往往不高。如果除去一般携带的抗性基因和GFP报告基因,则往往只余下3kb左右的容量供目的片段的插入。但我们可以通过载体改造去除一些不必要基因,在一些特殊情况下,可以最大插入4kb的基因片段。
 
2.你们的慢病毒载体上有什么报告基因?
 
答:目前我们主要提供的报告基因是绿色荧光蛋白EGFP和红色荧光蛋白tdTomato的载体系统。我们所选的这两个报告基因的荧光亮度都很高,同时是以单体的形式存在。此外,我们还可以根据客户的需要提供包含其它报告基因(如半乳糖苷酶lacZ或荧光素酶luciferase等)的载体系统。
 
3.我以前用过慢病毒感染造血细胞,但是表达不理想,你们有没有好的解决办法?
 
答:影响慢病毒载体介导的目的蛋白表达的因素主要是病毒的感染能力和特定的启动子在该细胞中的强度。VSV-G介导的慢病毒载体对造血系统的细胞的感染能力并不合适,除了常规用的VSV-G外,我们公司还拥有其它8种病毒包膜蛋白库,我们会根据客户的需要选择特定的包膜蛋白,或者是利用特定的启动子,从而使目的基因能在特定的细胞中得以高表达。
 
4.慢病毒是HIV开发出来的,这会不会比较危险?操作慢病毒的时候需要注意什么?
 
答:我们的慢病毒载体经过了一系列的改造,病毒在感染细胞中并不能自我复制,从而大大降低了其危险性。尤其是我们使用了现在最新型的四质粒包装系统,是目前重组系数最低的一个慢病毒包装系统,至今为止未见重组报道。而大部分其它公司常用的三质粒包装系统陆续出现过重组报道。慢病毒对加热、去垢剂、医用消毒水、福尔马林等均很敏感,但UV照射无法有效灭活。所以所有接触过病毒的器皿或枪头需要84消毒液浸泡半小时后用自来水冲洗 然后丢弃或回收即可。
 
5.如果我想在你们公司制备慢病毒需要提供什么?完成后你们公司最后会提供怎么样的慢病毒?大概花多长时间?
 
答:客户需要提供:(1)含有目标基因的质粒(包括测序图谱),或目的基因的名称及序列;(2)所需要的病毒滴度及总量,病毒是否需要纯化;(3)实验目的及要求,是否需要对照病毒;我们公司能提供滴度在1×108 TU/ml以上,体积为1 ml的纯化病毒(根据客户需要,不同量有价格差异)。如果是RNAi用的病毒,我们公司将承诺提供能有效抑制 目的基因的表达水平70%以上的病毒。一般而言载体构建及准备需要10-15个工作日,病毒包装及扩增需要20-30个工作日,滴度测定需要5-10个工作日,总计需要35-55个工作日。
 
 
6.你们提供的慢病毒我应该怎么保存呢?我能够反复冻融慢病毒吗?
 
答:我们提供的慢病毒可以长期置于-80 °C大概一年左右,其滴度不会有太大的降低。但是如果储存条件不佳,或是放置时间过长,我们建议客户在实验前重新对其滴度进行测定。我们不建议对慢病毒进行反复冻融。一般而言每次冻融都会使慢病毒活性损失5%以上,而且随着冻融次数的增加活性损失更明显。冻融一次后, 如果在一周内使用,可以放置于4 °C。
 
 

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