Tet-onoff
四环素(Tet)诱导系统利用Tet及其衍生物对目标基因进行诱导表达,具有精确、高效、可控性强且泄漏小的优点。其基本原理是通过诱导药物改变调控蛋白构象来控制目标蛋白的表达。Tet阻遏蛋白(TetR)对Tet操纵基因(TetO)DNA序列有特异性亲和力。当细胞中无Tet存在时,TetR与TetO结合阻断下游基因表达;当Tet存在时,TetR构象改变,脱离TetO,使基因表达恢复。Tet系统分为抑制型系统Tet-off和激活型系统Tet-on。
(1)抑制型系统Tet-off
载体包含Tet应答元件(TRE)、最小CMV启动子(PminCMV)和目标基因。当无Tet或其衍生物如强力霉素(Dox)存在时,tTA可与TRE结合开启基因表达;当Tet或Dox存在时,tTA构象改变,从TRE上脱离,基因表达关闭。
(2)激活型系统Tet-on
与Tet-off系统不同,Tet-on系统中的调控蛋白为反义Tet转录活化因子(rtTA)。在无Dox存在时,rtTA不结合TRE,基因表达关闭;在有Dox存在时,rtTA结合TRE,开启基因表达。
(3)Tet诱导系统的优点
低本底、高诱导倍数:无诱导剂时目的基因表达低,加入诱导剂可使表达增加至10,000倍;
精确调节:基因表达量与诱导剂量及时间成正比;
特异性高:无类似宿主DNA靶序列;
安全性:低剂量Tet安全性高;
快速性:加入诱导剂后30分钟内检测到目标基因表达;
可逆性:去除诱导剂后表达关闭,再次加入可重新开启。
活动依赖启动子
Tet | rAAV-pEF1α-DIO-EBFP-tTA(n)-WPRE-hGH polyA |
Tet | rAAV-pEF1α-EBFP-tTA(n)-WPRE-hGH polyA |
Tet | rAAV-EF1α-rtTAV16-WPRE-hGH polyA |