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蛋白互作

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Pulldown

Pull down原理

Pull down实验方案设计Pull down技术的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),但细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系,从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系

Pull down实验流程

1、构建含His或GST标签的诱饵蛋白原核或真核表达载体;
 
2、原核表达诱饵蛋白(我们采用自诱导培养基培养细菌,能有效降低包涵体的形成);
 
3、细菌裂解液过柱,带标签的诱饵蛋白被固相化亲和配基捕获,产生“次级亲和支持物”;
 
4、待测样品裂解液过柱孵育,与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附;
 
5、清洗,离心,去除未结合的杂蛋白;
 
6、洗脱,得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物;
 
7、如要验证某蛋白X与诱饵蛋白互作,则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育,做Western blot验证即可;
 
8、如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白,则需将6.所得的蛋白复合物做LC-MS/MS鉴定。




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